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實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ儀百科知識(shí)
１． 定義與概述
實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ儀（Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ， ｑＰＣＲ）是一種基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ＰＣＲ）技術(shù)，通過(guò)熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)ＤＮＡ擴(kuò)增過(guò)程的高精度分子生物學(xué)儀器。
核心功能：
定量檢測(cè)ＤＮＡ／ＲＮＡ的初始模板量（絕對(duì)定量或相對(duì)定量）。
檢測(cè)基因表達(dá)水平、病原體載量、基因突變等。
廣泛應(yīng)用于疾病診斷、基因研究、食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域。
２． 核心技術(shù)原理
熒光標(biāo)記機(jī)制：
ＴａｑＭａｎ探針?lè)ǎ禾结槑в袩晒饣鶊F(tuán)和淬滅基團(tuán)，擴(kuò)增時(shí)探針?biāo)忉尫艧晒狻?/p>
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法：染料嵌入雙鏈ＤＮＡ發(fā)出熒光，成本低但特異性稍差。
分子信標(biāo)（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ）：莖環(huán)結(jié)構(gòu)探針，靶序列結(jié)合后發(fā)光。
檢測(cè)模式：
終點(diǎn)法：僅檢測(cè)最終產(chǎn)物量。
實(shí)時(shí)法：通過(guò)Ｃｔ值（閾值循環(huán)數(shù)）動(dòng)態(tài)分析擴(kuò)增曲線，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量。
３． 核心參數(shù)與性能指標(biāo)
| 參數(shù) | 意義 | 典型范圍／要求 |
|---|---|---|
| 檢測(cè)通道數(shù) | 支持多色熒光檢測(cè)能力（如ＦＡＭ， ＨＥＸ， ＲＯＸ） | １－６通道（多用于多重ＰＣＲ） |
| 靈敏度 | 最低可檢測(cè)ＤＮＡ拷貝數(shù) | 單拷貝（＜１０ ｃｏｐｉｅｓ／μＬ） |
| 溫控精度 | 溫度均一性和升降溫速率 | ±０．１°Ｃ，升降溫≥４°Ｃ／秒 |
| 動(dòng)態(tài)范圍 | 線性定量范圍（Ｌｏｇ值） | ７－８?jìng)€(gè)數(shù)量級(jí)（１０＾１～１０＾８拷貝） |
４． 主要應(yīng)用場(chǎng)景
臨床診斷：
病毒／細(xì)菌核酸檢測(cè)（如新冠病毒、ＨＰＶ、結(jié)核分枝桿菌）。
腫瘤基因突變檢測(cè)（ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ等）。
科研領(lǐng)域：
基因表達(dá)分析（ｍＲＮＡ定量）。
ｍｉＲＮＡ檢測(cè)、ＳＮＰ分型。
農(nóng)業(yè)與食品：
轉(zhuǎn)基因成分鑒定。
食源性致病菌（如沙門(mén)氏菌）快速檢測(cè)。
５． 與傳統(tǒng)ＰＣＲ的對(duì)比
| 特性 | 實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ | 傳統(tǒng)ＰＣＲ |
|---|---|---|
| 定量能力 | 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，精準(zhǔn)定量（基于Ｃｔ值） | 僅終點(diǎn)定性／半定量（電泳分析） |
| 檢測(cè)速度 | １－２小時(shí)（含數(shù)據(jù)分析） | ２小時(shí)＋額外電泳時(shí)間 |
| 污染風(fēng)險(xiǎn) | 閉管操作，污染風(fēng)險(xiǎn)低 | 開(kāi)蓋電泳，易污染 |
| 成本 | 較高（熒光試劑／探針） | 低 |
６． 操作流程與注意事項(xiàng)
標(biāo)準(zhǔn)流程：
樣本制備：提取ＤＮＡ／ＲＮＡ并反轉(zhuǎn)錄為ｃＤＮＡ（ＲＮＡ檢測(cè)時(shí)）。
反應(yīng)體系配制：加入引物、探針、模板、Ｔａｑ酶等。
程序設(shè)置：設(shè)定擴(kuò)增程序（預(yù)變性→循環(huán)擴(kuò)增→熔解曲線分析）。
數(shù)據(jù)分析：通過(guò)軟件計(jì)算Ｃｔ值，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線或相對(duì)表達(dá)量。
關(guān)鍵注意事項(xiàng)：
避免ＲＮＡ降解（使用ＲＮａｓｅ抑制劑）。
防止交叉污染（分區(qū)操作、ＵＮＧ酶防殘留）。
驗(yàn)證引物特異性（熔解曲線單峰）。
７． 主流品牌與型號(hào)
| 品牌 | 代表型號(hào) | 特點(diǎn) |
|---|---|---|
| Ｂｉｏ－Ｒａｄ | ＣＦＸ９６ | 高性價(jià)比，５通道檢測(cè)，適合中小型實(shí)驗(yàn)室 |
| Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ | ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５ | 模塊化設(shè)計(jì)，支持高通量（３８４孔板） |
| Ｒｏｃｈｅ | ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ | 超快升降溫（１９°Ｃ／秒），精準(zhǔn)溫控 |
| Ｑｉａｇｅｎ | Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑ | 離心式溫控，均一性好，適合低濃度樣本 |
８． 未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)
數(shù)字化ＰＣＲ（ｄＰＣＲ）：通過(guò)微滴分區(qū)實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線。
便攜化設(shè)備：手持式ｑＰＣＲ儀（如ＢｉｏＦｉｒｅ ＦｉｌｍＡｒｒａｙ）用于床邊檢測(cè)。
ＡＩ整合：自動(dòng)優(yōu)化引物設(shè)計(jì)、智能分析擴(kuò)增異常曲線。
多重檢測(cè)升級(jí)：支持１０＋靶標(biāo)同步檢測(cè)（如病原體ｐａｎｅｌ篩查）。
９． 常見(jiàn)問(wèn)題（ＦＡＱ）
Ｑ：是否必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線？
Ａ：絕對(duì)定量需要標(biāo)準(zhǔn)品繪制曲線；相對(duì)定量（如２＾－ΔΔＣｔ法）可不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線。Ｑ：熔解曲線出現(xiàn)多峰怎么辦？
Ａ：可能為引物二聚體或非特異擴(kuò)增，需優(yōu)化引物濃度或退火溫度。Ｑ：如何提高低濃度樣本的檢測(cè)靈敏度？
Ａ：增加模板體積、使用高靈敏度探針（如ＴａｑＭａｎ ＭＧＢ）、減少抑制劑干擾。
總結(jié)
實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ儀憑借高靈敏度、快速定量、閉管防污染等優(yōu)勢(shì)，已成為分子診斷和基因研究的核心技術(shù)平臺(tái)。隨著數(shù)字化、微流控等技術(shù)的融合，其在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和即時(shí)檢測(cè)（ＰＯＣＴ）中的應(yīng)用將更加廣泛。
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